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[生物制剂] 蛋白质分离纯化方法之凝胶过滤层析法

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药徒
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楼主
发表于 2019-6-19 14:32:35 | 只看该作者 回帖奖励 |倒序浏览 |阅读模式

在进行蛋白质研究时,首先需要选择一套合适的蛋白分离和蛋白纯化方法来获取高纯度的生物制品,来进行下一步的研究。由于蛋白质具有颗粒大且不同蛋白质分子大小不同等特点,因此可以根据蛋白质分子大小不同而进行分离,这种分离方法有透析、超滤、离心和凝胶过滤,常包含在一些蛋白分离公司的服务中。凝胶过滤是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一,也称为分子排阻层析或分子筛层析。

凝胶过滤可以利用被分离物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点,将被分离物质各成分按照分子大小分开,从而达到分离的目的。在一些蛋白分离公司的服务中,凝胶过滤层析法常与其他层析方法配合使用。

1、凝胶过滤层析法的基本原理

凝胶过滤层析法的主要装置是填充凝胶颗粒的层析柱,柱中最常用的填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶,为惰性的多孔网状结构物质。当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入其内部,而是被排阻在凝胶颗粒外部,在颗粒之间的空隙中向下移动,并最先流出柱外。小分子物质能进入凝胶颗粒内部,因此流程较长。这样不同大小的分子因所经路径不同而得到分离,大分子物质先被洗脱出来,小分子物质后被洗脱出来。美迪西是一家12bet娱乐城12bet官网外包服务公司,提供蛋白质分离纯化技术服务,可以根据客户要求,提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务,并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。

凝胶过滤层析法用于蛋白分离和蛋白纯化,具有操作条件温和,适用于分离不稳定的化合物的特点。且凝胶颗粒不带电荷,不与被分离物质发生反应,因此溶质回收率接近100%,而且设备简单、分离效果好、重现性强,凝胶柱还可以反复使用,所以该方法被广泛应用于蛋白质等大分子物质非分离纯化、分子12bet测定、脱盐等试验中。

2、凝胶过滤层析法纯化重组人干扰素α2b的研究

将凝胶过滤层析方法用于通过基因工程方法获得的工程菌种纯化,可以制备高纯度的样品,提高生物活性,为进一步开展药学研究和长效制备提供了依据。干扰素是人和动物细胞受到合适的刺激时产生的一种微量的、具有高度生物学活性的糖蛋白,临床上用于治疗乙肝和丙肝的干扰素都是基因工程生产的干扰素蛋白质。其中干扰素a-2b和干扰素a-2a是干扰素a的两种类型,分别由干扰素a-2b基因和干扰素a-2a基因产生。

在干扰素药物12bet官网中,干扰素的制备是难点之一,虽然包涵体复性过程繁琐、收率低,但是表达量高、成本低和生产周期短,因此干扰素通常以大肠杆菌包涵体的形式表达。为了获得高活性高纯度的rh IFNα2b,研究者对重组人干扰素α2b进行克隆、表达,并深入研究了其纯化工艺[1]。

研究者采用重叠延伸PCR法合成了编码IFNα2b的基因,用DNA重组技术构建了原核表达载体p BV220-IFNα2b,获得了稳定的工程菌种。发酵产物通过破菌、洗涤获得包涵体,再经过变性、复性、离子交换层析和凝胶过滤层析的纯化,得到rh IFNα2b纯品,其比活可达1×10~8IU/mg。实验结果为进一步开展临床前研究和长效制剂奠定了基础。

在对蛋白质进行分离和纯化的过程中,为了获得产品纯度高和总回收率高的产品,常常需要将几种层析方法联合使用。总之在进行蛋白纯化时,首先需要明确分析纯化的目的和蛋白质的性质,进而来选择最佳的分离纯化方法,从而得到理想的实验结果。

[1]重组人干扰素α2b的制备研究[J].


药徒
沙发
发表于 2019-6-22 18:41:45 | 只看该作者
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法
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